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BRCA 数据解读中国专家共识

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10831 0 虎光着 发表于 2018-8-3 16:18:20 |

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本帖最后由 虎光着 于 2018-8-3 16:20 编辑 # F3 n6 T" X* E; d- S! t
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乳腺癌易感基因 ( breast cancer susceptibility gene, BRCA)是重要的抑癌基因与肿瘤易感基因,包括 BRCA1 及 BRCA2。 BRCA 在 DNA 修复的同 源性重组( homologous recombination)机制中扮演重 要角色,BRCA基因突变会导致基因组不稳定性显 著增加。 胚系 BRCA1 / 2 突变( gBRCAm) 将显著提 高女性乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症的发病风险。 近年来的研究发现,在一小部分无胚系BRCA 基因 突变患者的乳腺癌或卵巢癌肿瘤组织中也可以检测 到 BRCA 基因体细胞突变 (sBRCAm)。 BRCA 基因 也是与精准治疗密切相关的生物标志物,具有 BRCA1 / 2 突变的卵巢癌患者对铂类化疗非常敏感, 预后良好,并可获益于聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 (poly ADP⁃ribosepolymerase, PARP ) 抑 制 剂 的 治 疗[1] 。 随着精准医学和靶向治疗的进展,对相关肿 瘤患者血液和/ 或肿瘤组织进行 BRCA 突变检测将有助于更好地判断预后、选择靶向药物、选择化疗方 案、在适当的条件下对家族遗传史患者亲属的患病 风险进行评估,帮助医师根据患者的基因状态来选 取更精准的治疗方案。
BRCA1 / 2 基因序列较长,变异形式多样,变异 位点分散遍布于 2 个基因的全长[2] ,并且不是所有 的 BRCA变异都会损伤蛋白质功能,因而,变异的解 读是 BRCA 检测中一个关键的环节。 BRCA 基因变 异解读需要依据各类信息(包括来自群体数据库、 疾病数据库、文献和患者病史的信息)进行综合评 判。 近年来国外多个权威机构先后发布了 BRCA 基 因变 异 数 据 解 读 的 标 准 或 指 南。 目 前, 我 国 在 BRCA 基因变异数据解读领域尚缺乏规范性指导。因此,中华医学会病理学分会特组织分子病理学领 域的相关专家进行了充分讨论,并形成共识发布,以 指导与规范我国 BRCA 基因检测数据的解读,推动 BRCA 检测在我国的临床应用。
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一、 BRCA变异类型、检测区域及检测方法
BRCA 变异类型主要包括点突变、小片段插入/ 缺失 和 大 片 段 重 排 ( large rearrangement ) 等。 除 BRCA 基因编码区的变异外,内含子发生的一些变异亦可能会通过干扰 RNA 剪切等方式影响蛋白质 功能,因此 BRCA 检测必须同时覆盖编码区和相邻 边界区(以±20bp 为佳)。
Sanger 测序是检测 BRCA基因点突变和小片段 插入缺失的传统技术,也可以作为其他检测方法的 补充或结果验证手段。 多重连接依赖性探针扩增 ( multiplex ligation⁃dependentprobe amplification assay, MLPA)、 定 量 聚 合 酶 链 反 应 ( quantitative polymerase chainreaction,qPCR)和长片段聚合酶链 反应 ( long range PCR, L⁃PCR) 是 目 前 用 于 检 测 BRCA 基因大片段重排的三个主要技术平台。
近 年 来, 随 着 二 代测 序 ( next generation sequencing,NGS)技术的飞速发展,国内外越来越多 的实验室已将 NGS 技术应用于 BRCA 基因变异的临床检测。 除应用于点突变和小片段插入缺失的检 测外,在测序策略和生物信息学工具方面有着特殊 设计的 NGS 也可用于大片段重排的检测。

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二、 BRCA基因变异命名规则
推荐使用人类基因组变异协会(Human Genome Variation Society, HGVS)命名法作为基因变异命名 的主要指导原则以规范基因序列变异的命名。同时 参考序列必须包含在内以确保基因变异命名的准确 无误。 HGVS 命名法的首选 DNA 编码参考序列是 基因座参考基因组序列( Locus ReferenceGenomic sequence, LRG, http: / / www􀆰 lrg⁃sequence􀆰 org / ),但LRG 尚未被广泛应用在解读的数据库和文献里。 因此根据目前的情况,推荐使用最常用的 2 个转录 本序列, 分别为 NM _ 007294􀆰 3 ( BRCA1) 和 NM _ 000059􀆰 3(BRCA2),相应的蛋白质参考序列为 NP_ 009225􀆰 1(BRCA1) 和 NP _000050􀆰 2(BRCA2)。 同 时推荐使用命名工具( https: / /mutalyzer􀆰 nl)对基因 变异的 HGVS 命名进行校验。

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三、 BRCA变异分类
根据国际癌症研究机构( International Agency for Research on Cancer, IARC) [3] 、美国医学遗传学 与基 因 组 学 学 会 ( American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG) [4⁃5]和胚系突变等位基因解读实证联盟(Evidence⁃based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles,ENIGMA, https: / / enigmaconsortium􀆰 org / ) [6] 的 分 类 系 统, 将 BRCA 基因变异按照风险程度由高至低分为以下5 类:
致病性(5 类,致病可能性>0􀆰 99)、
可能致病性 (4 类,致病可能性在 0􀆰 95 ~ 0􀆰 99 之间)、
意义未明 (3 类,致病可能性在 0􀆰 05 ~ 0􀆰 949 之间)、
可能良性 (2 类,致病可能性在 0􀆰 001 ~ 0􀆰 049 之间)
良性 (1 类,致病可能性<0􀆰 001)。
受试者的总体 BRCA 状况应为其所有 BRCA1 / 2 基因变异中风险程度最 高的类别。
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四、 BRCA变异解读
目前,BRCA 变异解读最权威的指南或标准包 括:ACMG 和 美 国 分 子 病 理 学 会 ( Association for MolecularPathology,AMP) 序列变异解读标准和指 南( 2015 版) [4] , 欧 洲 分 子 基 因 诊 断 质 量 联 盟 ( European Molecular GeneticsQuality Network, EMQN)遗传性乳腺癌/ 卵巢癌分子遗传分析最佳实 践指南(2008 版) [7]和 ENIGMA BRCA1 / 2 基因变异分类标准(1􀆰 1 版) [6] 。
ACMG 于 2000 年发布了第 1 版变异解读总体 指南,并于 2007 年进行了修订,2015 年 ACMG 和 AMP 联合发布了该变异解读指南的最新版本。EMQN 是一家为全球实验室提供室间质量评估 (external quality assessment) 服务的非营利性机构, 致力于提高临床分子遗传学检测质量。1999 年 EMQN 起草了第 1 版遗传性乳腺癌/ 卵巢癌分子遗 传分析最佳实践指南,并于 2007 年 EMQN 研讨会 讨论,后在 2008 年更新了该指南。ENIGMA 是一个 国际研究者联盟,致力于确定 BRCA1、BRCA2 和其 他已知或可疑乳腺癌基因序列变异的临床意义。 基 于已发表的指南(包括 ACMG2007 版)和各成员制 定的分类标准,ENIGMA 于 2015 年发布了专门针对 BRCA1 / 2 的变异分类标准。 在其标准里,ENIGMA 根据已知的对功能域的认知,总结了BRCA1 / 2 的功 能域以及可能恢复 BRCA1 / 2 基因功能的自然存在 的框 内 RNA 异 构 体 ( naturally occurring in⁃frame RNAisoforms;表 1)。
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除此之外,ENIGMA还发表了 一些针对临床意义未明变异的研究。 这些都是变异 解读非常有用的资源。 同一变异依据不同的解读指 南或标准所得到的解读结果可能会略有差异,因而 我们建议在变异解读时具体指明所依据的指南或标准名称。
综合以上指南解读规则以及BRCA 基因的特 征,我们总结出以下解读规则:

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1.致病性( pathogenic)⁃5 类。 包括以下几种情 况:
(1)编码提前终止密码子的序列变异,即 BRCA1 第 1 855 位氨基酸和 BRCA2 第 3 309 位氨基酸前发生的无义突变或移码突变。
(2)发生在剪切位点即 外显子上下游第一或第二个碱基的变异,但是,需除外经预测或已明确的可产生可能恢复 BRCA1 / 2基 因功 能 的 自 然 存 在 的 框 内 RNA 异 构 体 的 变 异 (表 1)。
(3)拷贝数缺失变异,该变异导致 BRCA1 第 1 855 位氨基酸和 BRCA2 第 3 309 位氨基酸前发 生移码突变,或者该变异移除1 个或多个外显子且 不是经预测或已明确的可产生可能恢复 BRCA1 / 2 基因功能的自发框内 RNA 异构体的变异。
(4) 任 意大小的拷贝数重复变异,该变异导致 1 个或多个 外显子重复并已被证实会导致 BRCA1 第 1 855 位氨基酸和 BRCA2 第 3 309 位氨基酸前发生移码突 变。
(5)体外或体内功能研究显示对基因或基因产 物有破坏作用且与肿瘤高危相关的其他类型变异。

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2.可能致病性( likely pathogenic)⁃4 类。
包括以下几种情况:
(1)  该变异经 mRNA 水平的实验证实 能够改变剪接,但是不会产生可能恢复基因功能的 自然存在的框内RNA 异构体。
(2)  该变异编码的 氨基酸改变与之前定义的 5 类致病性错义突变相 同,但发生改变的基础核苷酸不同,而且既往疾病关联并非由剪接事件所致,并且变异未见于作为对照 的外显子组测序项目(Exome Sequencing Project)、 千人基因组计划(1000 GenomesProject) 或外显子 组整合数据库(Exome Aggregation Consortium),或变 异位于已确认的功能区。
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(3)移除密码子的小片段 框内缺失变异,该变异涉及的氨基酸位点已被证实 可发生错义替换 5 类变异,且既往疾病关联并非由于剪接事件所致,并且变异未见于作为对照的外显 子组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数 据库,或变异位于已确认的功能区。
(4)体外或体 内功能性研究显示对基因或基因产物有破坏作用的 其他类型变异,并且变异未见于作为对照的外显子 组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数据 库,或者变异位于已确认的功能区。
3.意义未明(uncertain significance)⁃3 类:证据 不足以将其归类为 1、2、4 或 5 类的变异,或证据与 良性和致病性分类相矛盾的变异。
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4.可能良性( likely benign)⁃2 类。 包括以下几 种情况:

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(1)该变异编码的氨基酸改变与已确认的 1 类良性变异相同,但发生改变的基础核苷酸不同,且 无证据表明该变异会导致剪接事件。
(2)个体发生 的胚系变异与已知致病变异在同一基因上呈反式 (in trans)排列,且该个体除了 BRCA 相关肿瘤外无明显其他临床表征。

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5. 良性(benign)⁃1 类:
(1)外显子组测序项目、 千人基因组计划或外显子组整合数据库中等位基因 频率>5% 的变异。
(2)体外或体内功能研究显示对 蛋白质功能或剪接无破坏作用的变异。
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五、 BRCA变异解读数据库
变异解读的关键步骤之一是收集证据,并基于 这些证据对变异进行分类。 数据库是挖掘这些证据 的重要资源。 表 2 列出了一些常用的数据库,依使 用情况分为2 类:群体数据库和 BRCA 相关数据库。 群体数据库记录的是以种群为基础的研究中发现的 变异。 大群体中的变异频率可从此类数据库中获 取。 BRCA1 /2 变异相关研究已开展多年,有一些专 门收集 BRCA 变异的数据库和积累大量 BRCA 变异 的疾病数据库,可从中找到变异解读和相应的支持 证据。
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六、 BRCA检测报告
一份完整的 BRCA 检测报告要能够被肿瘤科医 师或其他非分子病理学专业的医师理解,报告内容应至少包括以下部分:样本信息、检测结果、基因变 异分类的详细解释、检测方法和覆盖区域、签名和联系信息。 样本信息部分应包括患者基本信息、样本 类型、临床诊断、家族史。 若送检的是肿瘤组织,样 本信息部分还应该包括病理诊断、肿瘤细胞含量、取 材时间、样本处理方式等信息[10]。 检测结果部分应 列出在该被检测者中发现的所有 2 ~ 5 类基因变异 和总体 BRCA 状态。 基因变异分类的详细解释部分 应提供基因变异分类证据的简要说明。检测方法和 覆盖区域部分应明确描述使用的是何种 BRCA 检测 方法以及该方法覆盖的指定序列区域。 签名和联系 信息部分应列出实验操作、数据分析与报告撰写、报告复核的人员姓名及便于进一步问询的联系信息。 数据分析人员应具有临床医学、分子生物学或遗传 学知识背景并经生物信息学培训。 最终报告应由中 级或硕士以上具有相关背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人(高级职称或医学博士学 位) 审核。 检测报告模板如表 3。
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