伴有EGFR突变的非小细胞肺癌血清CYFRA21-1和CEA水平与EGFR-TKIs的疗效关系
肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8%[1]。非小细胞癌（non-small cell lungcancer, NSCLC）约占所有肺癌病理类型85%，而且>70%的患者确诊都是晚期[2]。全身化疗一直是这部分人群主要治疗方法。21世纪初随着分子生物学研究不断深入，开启了NSCLC以表皮生长因子受体（epidermal growthfactor receptor, EGFR）基因突变为指导的靶向治疗时代，而IPASS、NEJGSG、WJTOG3405、OPTIMAL、EURTAC、LUX-Lun3及ICOGEN等研究，进一步确立表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）在EGFR基因突变的NSCLC晚期患者治疗地位[3-9]。血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）和细胞角蛋白19片段（cytokeratin-19 fragments, CYFRA21-1）是最常见肿瘤标志物，应用于肺癌的诊断、预后和监测。目前认为CEA是肺腺癌较好的肿瘤标志物，而CYFRA21-1则是肺鳞癌诊断的最好肿瘤标志物。本文回顾性研究伴有EGFR基因的突变NSCLC晚期患者治疗前血清CEA和CYFRA21-1的水平和EGFR-TKIs疗效及预后的关系，希望给临床EGFR-TKIs靶向治疗的个体化提供参考依据。
1 资料与方法
1.1 对象 本研究收集首都医科大学附属北京胸科医院于2010年10月-2015年3月EGFR基因突变且应用EGFRTKIs治疗的患者194例，所有患者均通过病理及免疫组化诊断为NSCLC，并且为IIIb期-IV期或者手术后复发的晚期患者。患者年龄30岁-85岁（中位年龄58岁），男性86例（44.3%），女性108例（55.7%）。PS评分0分-1分166例（85.6%），2分-4分28例（14.4%）。吸烟67例（34.5%），非吸烟127例（65.5%）。IIIb期患者6例（3.1%），IV期188例（96.9%），中心型26例（13.4%），周围型168例（86.6%）。腺癌179例（ 9 2 . 3%） ， 鳞癌9 例（ 4 . 6%） ， 非小细胞癌3 例（1.5%），腺鳞癌2例（1%），大细胞癌1例（0.5%）。
1.2 治疗方法 所有患者都给予埃克替尼或者吉非替尼、厄洛替尼治疗。埃克替尼125 mg，每日3次口服；吉非替尼250 mg，每日1次；厄洛替尼150 mg每日1次。接受埃克替尼治疗115例（59.3%），吉非替尼44例（22.7%），厄洛替尼35例（18%）。
1.3 EGFR基因检测 采取两种方法：一种PCR-Sanger测序法，由北京海思特临床检验所检测；一种ARMS荧光定量PCR，检测试剂为厦门艾德人类EGFR基因突变测试剂盒。应用PCR-Sanger测序法123例（63.4%），ARMS法71例（36.6%）。标本来源：气管镜活检47例（24.2%），肺穿刺活检88例（45.4%），胸水沉淀包埋31例（16%），手术标本13例（6.7%），淋巴结活检14例（7.2%），骨转移穿刺1例（0.5%）。EGFR基因检测结果：19外显子缺失突变112例（57.7%），21外显子错义突变72例（37.1%），少见突变3例（G719X）（1.5%），伴有原发T790m突1例（0.5%），EGFR基因突变2例（1.0%），伴有Kras突变2例（1.0%），19外显子错义突变2例（1.0%）。
1.4 血清CEA和CYFRA21-1的检测
EGFR-TKIs治疗前清晨空腹静脉血，分离血清后，使用上海透景生命科技股份有限公司试剂盒及Luminex多功能流式点阵仪应用流式荧光发光法进行测定。根我院试剂盒正常参考值进行结果判定：CEA≤6 ng/mL为正常，CEA>6 ng/mL为表达水平增高；CYFRA21-1≤6 ng/mL为正常，CYFRA21-1>6 ng/mL为表达水平增高。
1.5 疗效评定及生存指标 治疗前2周对疾病状况进行
评估，治疗后4周复查。以后每2个月-3个月随访1次。按实体瘤疗效评价标（Response Evaluation Criteria inSolid Tumors, RECIST）评价近期疗效，分为完全缓解（complete response, CR）、部分缓解（partial response,PR）、疾病稳定（s t abl e di s e a s e , SD）和疾病进展（progressive disease, PD）。生存指标为无进展生存时间（progression-free survival, PFS）定义为EGFR-TKI治疗开始至疾病进展或未进展死亡的时间。总生存（overall survival,
OS）定义为EGFR-TKI治疗开始到死亡或末次随访时间。
1.6 统计学方法 使用SPSS V22.0软件，采用Kaplan-Meier法并进行Log-rank检验生存分析，用Cox比例风险模型进行多因素分析，所有统计结果以P<0.05为差异有统计学意义。所有患者均随访至2015年12月31日，其中死亡103例，存活90例，1例失访。死亡病例为截尾数据，存活病例为未截尾数据。
2 结果
2.1 EGFR-TKIs疗效及多因素生存分析 本研究中患者的总体疗效：CR、PR、SD、DCR及PD分别为0.5%（1例）、68.6%（133例）、24.2%（47例）、93.3%（181例）和6.7%（13例）。中位PFS为9.0个月（95%CI: 7.3-10.7）；中位总生存OS为23.0个月（95%CI:20.2-25.8）。单因素生存分析显示：年龄>70和年龄≤70岁PFS分别为9.0个月和10.5个月（P=0.495）；OS分别为23.0个月和24个月（P=0.441）；男性和女性PFS分别为10.5个月和8.2个月（P=0.391）；OS分别为24.0个月和21.8个月（P=0.717）；吸烟和非吸烟PFS分别为10.5个月和8.9个月（P=0.406）；OS分别为24.1个月和21.8个月（P=0.886）；19外显子缺失突变和21外显子错义突
变PFS分别为9.0个月和8.2个月（P=0.375）；OS分别为24.1个月和17.2（P=0.143）；以上单因素分析均无统计学差异。PS评分0分-1分和2分-4分PFS分别为10.5个月和5.3个月（P<0.001）；OS分别为24.8个月和9.7个月（P<0.001）；腺癌和鳞癌PFS分别为9.0个月和4.1个月（P=0.009）；OS分别为23.1个月和8.1个月（P<0.001）；
治疗前基线无脑转移和伴有脑转移PFS分别为10.9个月和7.5个月（P=0.001）；OS分别为26.1个月和14.3个月（P<0.001）；无肝转移和伴有肝转移PFS分别为10.2个月和7.0个月（P=0.002）；OS分别为23.7个月和12.0个月（P=0.008）。上述单因素分析有统计学差异。多因素生存分析显示PS评分状态和是否伴有脑转移PFS和OS都有统计学意义。而组织类型中腺癌和鳞癌PFS无统计学差异，但在O还是有统计学差异（表2，表3）。
2.2 治疗前血清CYFRA21-1水平与PFS、OS的相关性分析194例患者中129例血清水平CYFRA21-1正常，65例血清CYFRA21-1水平增高，血清水平CYFRA21-1正常和增高的PFS分别为11.9个月和7.0个月（P<0.001），OS分别为28.0个月和12.6个月（P<0.001），均有统计学差异（表2）。亚组分析中，腺癌组120例血清CYFRA21-1水平正常，59例血清水平增高，它们的PFS分别为12.0个月和7.0个月（P<0.001），OS分别为28.1个月和13.1个月（P<0.001）均有统计学差异（表4）。多因素分析中（表3），PFS（P=0.006, HR=0.62, 95%CI: 0.44-0.87）（图1），OS（P<0.001, HR=0.30, 95%CI: 0.19-0.47）（图2），也均有统计学差异。鳞癌组4例血清水平CYFRA21-1正常，5例血清水平增高，它们的PFS分别为4.1个月和3.1个（P=0.529），OS分别为8.1个月和7.0个月（P=0.359），均无统计学差异。
2.3 治疗前血清CEA水平与PFS和OS的相关性分析
血清CEA水平正常69例，血清CEA水平增高125例。它们的PFS分别为10.2个月和8.9个月（P=0.294），OS分别为24.0个月和21.8个月（P=0.122）均无统计学差异。腺癌亚组血清CEA水平正常及增高的PFS均为9.0个月（P=0.436），无统计学差异（图3）；OS分别为24.8个月和23.0个月（P=0.104），无统计学差异（图4）。鳞癌亚组血清CEA水平正常2例，血清水平增高7例；它们的PFS分别为7.8个月和3.1个月（P=0.103），无统计学差异；OS分别为9.1个月和7.0个月（P=0.381）无统计学差异（表2-表4）。
3 讨论
2004年Lynch等[10]研究发现EGFR基因突变状态与EGFR-TKIs的疗效相关，并且近几年多项国际多中心的临床研究已显示EGFR-TKIs在EGFR基因突变的NSCLC晚患者有着非常好的疗效及低毒性[3-9]。2012年在美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）NSCLC临床实践指南推荐对于EGFR基因突变的晚期，复发或转移的NSCLC患者EGFR-TKIs作为一线治疗。随着对EGFR-TKIs进一步研究，发现同样有EGFR基因突变，但不同的临床特征，EGFR-TKIs疗效是有差异的。Lee等[11]meta分析中认为女性，非吸烟患者，腺癌及19外显子缺失突变，相对疗效更好一些。我们的研究显示，性别、年龄、吸烟状态及EGFR基因敏感突变类型之间无统计学差异。但是PS评分0分-1分较2分-4分疗效更好，有统计学差异；腺癌较鳞癌患者EGFR-TKIs疗效更好，有统计学差异。在合并有远处转移，有脑转移和肝转移的患者PFS和OS均有缩短。多因素生存分析显示：PS状态差，鳞癌和伴有脑转移的患者预后差，OS有统计学意义。
CYFRA21-1是我们临床实践中肺癌诊断常用肿瘤标志物。当肿瘤细胞发生溶解时，其中的细胞角质蛋白释放入血，而使血中CYFRA21-1升高。其对肿瘤的诊断敏感性约为50%，且以鳞癌敏感性最高。有报道其对鳞癌的敏感性和特异性分别为66.5%和95%[12]，因此众多学者一致认为CYFR21-1是鳞癌鉴别诊断的最好肿瘤标志物，其水平高低和敏感度与病情呈正相关。近年Tanaka等[13]提出伴有EGFR突变的NSCLC，治疗前血清CYFRA21-1水平是预测EGFR-TKIs疗效的指标，但相关报道国内外还是比较少。我们的研究显示治疗前血清水平CYFRA21-1正常和增高的PFS分别为11.9个月和7.0个月（P<0.001），OS分别为28.0个月和12.6个月（P<0.001），均有差异.亚组分析中，腺癌组血清CYFRA21-1水平正常和增高的PFS分别为12.0个月和7.0个月（P<0.001），OS分别为28.1个月和13.1个月（P<0.001）均有差异。多因素分析中，PFS（P=0.006,HR=0.62, 95%CI: 0.44-0.87），OS（P<0.001, HR=0.30,95%CI: 0.19-0.47）也均有统计学差异。鳞癌组血清水平CYFRA21-1正常和增高的PFS分别为4.1个月和3.1个月（P=0.529）， OS分别为8.1个月和7.0个（P=0.359），均无差异。我们研究显示伴有EGFR基因突变的肺腺癌患者，治疗前血清CYFRA21-1水平增高较正常水平相比较，PFS和OS都有缩短；治疗前血清CYFRA21-1水平可以预测EGFR-TKIs疗效及预后。而肺鳞癌在我们研究中由于病例数较少，并未显示治疗前血清CYFRA21-1水平与EGFR-TKIs的疗效和预后的关系。
E G F R 基因突变， 在肺腺癌患者比较常见，PIONEER临床试验显示东亚肺腺癌患者50.2%的EGFR基因的突变率[14]。而肺鳞癌患者EGFR基因的突变比较少见，Dearden等[15]meta分析中，东亚肺鳞癌患者EGFR基因的突变率仅为4.6%，而中国报道肺鳞癌患EGFR基因的突变则在14%-25%[16-18]。并且在既往的报道EGFR基因突变肺鳞癌患者采用EGFR-TKIs治疗的PFS和OS明显低于肺腺癌，PFS在3个月-7个月，OS在9.4个月-14.7个月[19-21]。本研究中EGFR基因的突变患者鳞癌患者9例，为4.6%。与肺腺癌相比PFS分别为4.1个月和9.0个月（P=0.009），OS分别为8.1个月和23.1个月（P<0.001）。肺鳞癌EGFR突变患者临床受益程度明显低于EGFR突变肺腺癌患者，似乎提示肺鳞癌中具有EGFR突变基因也许并不是靶向治疗的“驱动基因”，可能存在其他肿瘤驱动机制。肺癌的组织类型较多，且以腺癌的组织分型最复杂，异质性最明显。Travis等[22]认为由于肿瘤组织的异质性，基于小标本的病理组织诊断是有限，有可能会带来相反的组织类型诊断。并且由于肿瘤组织的异质性，小标本病理活检有可能未体现出整体的病理组织类型状态。我们的研究患者均为IIIb期-IV期晚期患者，标本来源：气管镜活检47例（24.2%），肺穿刺活检88例（45.4%），胸水沉淀包埋31例（16%），手术标本13例（6.7%），淋巴结活检14例（7.2%），骨转移穿刺1例（0.5%），绝大部分是小标本的病理活检。肺腺癌患者血清水平CYFRA21-1异常增高，我们考虑由于肿瘤异质性，可能混有鳞癌的成份，而肺鳞癌较肺腺癌相比较，EGFR-TKIs疗效不佳，那么治疗前血清CYFRA21-1水平异常增高可能带来EGFR-TKIs治疗的不佳疗效。而我们研究也显示伴有EGFR基因突变的肺腺癌者，治疗前血清CYFRA21-1水平增高，PFS和OS都短，血清CYFRA21-1水平可能是预测EGFR-TKIs治疗的疗效及预后的指标。
CEA是最早发现，目前临床应用最广的一种肿瘤抗原，在成人肺、乳腺和胃肠等腺癌组织有表达。肺癌细胞可合成和释放CEA，目前认为CEA是肺癌尤其是腺癌的进展、疗效和预后评估较好的一个肿瘤标志物[23]。与血清CYFRA21-1不同，近年的相关报道显示治疗前血清CEA水平并不能预测EGFR-TKIs治疗的疗效。我们的研究显示治疗前血清CEA水平正常和增高的PFS分别为10.2个月和8.9个月（P=0.294），OS分别为24.0个月和21.8个月（P=0.122）均无统计学差异。腺癌亚组血清CEA水平正常及增高的PFS均为9.0个月（P=0.436），无统计学差异；OS分别为24.8个月和23.0个月（P=0.104），无统计学差异。鳞癌亚组血清CEA水平正常和增高的PFS分别为7.8个月和3.1个月（P=0.103），OS分别为9.1个月和7.0个月（P=0.381），均无统计学差异。这些表明治疗前血清CEA水平与伴有EGFR突变的NSCLC的EGFR-TKIs治疗的疗效无关，并不能预测EGFR-TKIs治疗的疗效。
我们的研究显示， 肺腺癌中治疗前血清水平CYFRA21-1增高与正常相比较EGFR-TKIs治疗PFS和OS都有缩短，而国外相关研究报道治疗前血清水平CYFRA21-1增高的患者EGFR-TKIs治疗仅有PFS缩短，因为进展后的相关治疗，两组总的OS是无统计学差异的。那么在我们的研究中出现的OS的显著性缩短，分析其原因可能是，我们研究中194例患者中有159例出现进展，而42例（26.4%）患者随后未再进行化疗、放疗或者其他的靶向药物治疗，而仅仅给予姑息维持治疗，从而导致OS进一步缩短。说明在我们临床实践中初次的EGFRTKIs治疗明显影响OS。NCCN指南中，对于伴有EGFR突变的NSCLC的推荐单药EGFR-TKIs一线治疗，但关于如何延EGFR-TKIs治疗PFS的探索性研究近年不断涌现。FASTACTII、NEJ005及JO2557等[24-26]多中心的临床研究显示，EGFR-TKIs和化疗交替应用，或者联合化疗药物，抗血管药物可以延长PFS至15个月-16个月。但由于临床研究设计的局限性或两药联合应用增加的副反应，给这些研究带来许多争议。那么对于肺腺癌EGFR基因突变患者，治疗前血清CYFRA21-1水平异常增高且预测单药EGFR-TKIs可能疗效不佳，给EGFR-TKIs和化疗交替应用或者联合化疗药物，是否能延长这部分人群PFS，从而提高OS,这还需要将来临床实验进一步探索研究。
我们的研究存在许多局限性和不足，首先这是个回顾研究，随访时间2个月-3个月随访一次；并且EGFR基因突变的检测方法没有统一，而是采取两种方法，PCRSanger测序法和ARMS荧光定量PCR法，但两种方法PFS和OS都没有统计学差异；我们的研究应用EGFR-TKIs药物也不是统一，包括有埃克替尼、吉非替尼和厄洛替尼，但是在我们的研究里，这三个EGFR-TKI药物无论PFS和OS也都没有统计学差异。虽然有许多局限性和不足，但是从我们的研究中可以看到伴有EGFR突变的NSCLC的EGFR-TKIs治疗疗效还是有许多差异，提示我们可以针对特定人群给予个体化治疗。综上所述，我们研究的结论是：伴有EGFR突变的NSCLC的EGFR-TKI治疗中，PS状态差、鳞癌和伴有脑转移的患者EGFR-TKIs治疗预后差。小标本病理有其局限性，有时是不能代表整体病理组织类型。伴有EGFR突变的肺腺癌患者，治疗前血清水平CYFRA21-1增高者与正常者相比，EGFR-TKIs治疗的PFS和OS均有缩短，治疗前血清CYFRA21-1水平可以作为预测EGFR-TKIs疗效指标，也可能是EGFR-TKIs治疗的预后指标；而治疗前血清CEA水平则不能预测EGFR-TKIs疗效。
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