Nature：TIM-3与CEACAM-1在癌症反应中介导T细胞免疫耐受

        2015年1月21日 讯 /生物谷BIOON/ --免疫疗法（immunotherapy）是最近新兴的一种癌症治疗手段，其目的在于引导患者产生针对癌症细胞的特异性免疫反应。在最近的研究中，这种方法配合传统的手术与放射治疗具有出明显的优势。然而，作为基因突变的产物，癌细胞与人体正常细胞的特征十分相似，因此在诱导癌细胞特异性免疫反应过程中"自体免疫耐受"成为不可忽视的影响因素。

                               
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TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）是一类T细胞表面抑制性分子，能够引起癌症与慢性病毒感染过程中T细胞的衰竭。与CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4），PD-1（programed death-1）相同，TIM-3也是目前研究最多的免疫治疗的靶点之一。因此，TIM-3引导免疫耐受的机制十分值得研究。最近哈佛大学医学院Richard S. Blumberg课题组在《自然》杂志发表了他们对TIM-3引导免疫耐受的机制的研究。

首先作者根据之前发现的实验现象："T细胞表面表达CEACAM-3蛋白，这一蛋白可以介导免疫耐受"，利用OT-II小鼠（该小鼠CD4+ T细胞特异性识别OVA蛋白323-339的多肽）以及Ceacam-1（carcinoembryonic antigen cell adhesionmolecule-1）缺失突变OT-II小鼠建立免疫耐受模型。实验结果显示，OVA323-339多肽能够引发野生型OT-II小鼠产生免疫耐受（即CD4+ T细胞增殖受到抑制），然而，Ceacam-1-/- OT-II小鼠则没有出现免疫耐受的现象。之后，作者通过过继移植（adoptive transfer）的方法将CFSE标记的OT-II na?ve CD4+T细胞（这种标记手段可以实现通过流式检测分析细胞增殖情况）分别转移入野生型与Ceacam1-/- 小鼠体内，并辅以OVA323-339多肽的刺激。之后的流式分析显示：导入Ceacam-1-/- 小鼠体内的OT-II na?ve CD4+T细胞其增殖能力明显高于野生型小鼠。出人意料的是，作者发现这部分CD4+T细胞中TIM-3的表达与Ceacam-1的表达具有非常强的相关性。暗示了T细胞表面TIM-3与Ceacam-1存在共表达的特性。

由于TIM-3的配体之前一直不清楚，作者猜想是否TIM-3与Ceacam-1在T细胞表面存在相互作用。作者在HEK293细胞系中过表达hTIM-3与hCeacam-1蛋白，后续的免疫共沉淀实验证明两者存在相互作用，而且TIM-3或Ceacam-3内部若干氨基酸残基的突变会减弱这种相互作用。作者通过结晶学的手段得到了TIM-3与Ceacam-3的共结晶结构，结果显示TIM-3与Ceacam-1在N-端具有非常强的相互作用。至此，生化方式最终证明了两者的关系。

通过代谢标记的方式，作者发现Ceacam-3的存在会增强TIM-3的表达，然而当ceacam-3或TIM-3发生突变后，TIM-3会出现过度的糖基化，并且失去上膜的能力，在细胞内部过度积累。随后，通过比较TIM-3tg，TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠TIM-3在SEB（superantigen staphy2 Tolococcal enterotoxin B，一类可以引起免疫耐受的抗原，作用于OVA类似，但不需要特异性T细胞转基因小鼠）刺激前后的表达水平以及分布情况，发现TIM-3tg小鼠CD4+ T细胞TIM-3在接受刺激后表达量上升，并且上膜效率提高（通过生化与流式分析手段证明），显示出免疫耐受的特性；然而，TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠T细胞TIM-3的表达量与分布则没有如上变化。

在此工作的基础上，作者分析了的TIM-3与 Ceacam-1参与免疫耐受分子机制。作者通过对野生型CD4+T细胞进行Anti-CD3&Anti-CD28的体外刺激，并分别接受N- Ceacam-1的体外刺激与空白处理。结果显示，对照组T细胞出现大量增殖，而N- Ceacam-1刺激后的细胞对Anti-CD3&Anti-CD28的刺激不再敏感。这一结果证明了Ceacam-1负向调控的能力。那么这一作用是否需要TIM-3参与呢？BAT-3是TIM-3下游的一个抑制性分子，它可以与TIM-3进行结合从而抑制TIM-3的活性。作者比较了TIM-3tg（对SEB免疫耐受敏感）以及TIM-3tg Ceacam-1-/-（对免疫耐受不敏感）的小鼠CD4+ T细胞在接受上述刺激之后TIM-3与BAT3的相互作用情况。免疫共沉淀结果显示：在接受刺激之前，两组细胞具有相当的相互结合能力，但在N- Ceacam-1刺激之后，TIM-3tg 小鼠 T细胞中TIM-3与BAT3的相互作用减弱，说明TIM-3得到了活化；而在TIM-3tg Ceacam-1-/-小鼠T细胞中两者的相互作用反而增强了。以上结果说明了Ceacam-1通过TIM-3信号通路影响了T细胞的免疫耐受。

那么体内真实的情况是怎样的呢？作者通过过继转移的方式向Ceacam-1-/- Rag 2-/-小鼠体内注入野生型的na?ve T细胞，导致了大肠的炎症反应。之后，作者对大肠部位浸入的T细胞的进行了特征分析。结果显示：TIM-3+ Ceacam-1+细胞IL-2，IFN-γ，IL-17A等效应性分子标记表达量远远低于其它类群的细胞。同时，当注入的是Ceacam-1-/- T细胞时，这群细胞TIM-3的表达量远低于野生型细胞，而且同时TNF-α的表达量也开始增强。作者进行了其它一些病理指标的分析，证明Ceacam-1促进了小鼠的免疫耐受反应。

最后，作者研究了Ceacam-1以及TIM-3在肿瘤特异性免疫反应过程中的作用。研究发现：在人工诱导的小鼠大肠癌模型中，Ceacam-1+TIM-3+细胞的比例远高于其它类群的CD4+ T细胞，同时，Tim3tg小鼠对大肠癌的致死率是100%，远高于野生型小鼠及Ceacam-1-/-小鼠。其它一些病理指标与体外检测同样表明Ceacam-1与TIM-3抑制了T细胞对癌细胞的免疫反应。

综上，作者通过一系列遗传学与免疫学手段证明Ceacam-1与TIM-3联合作用导致T细胞对各类疾病产生免疫耐受。其下游的信号传递方式还需要进一步研究。

免疫耐受是一把"双刃剑"，在自身免疫病中，耐受具有积极的作用，而在癌症发生过程中，免疫耐受却存在消极的影响。作为与PD-1，CTLA-4相似的分子，CEACAM-1与TIM-3也是免疫治疗与药物开发领域热门的靶点分子。希望我们将来可以在全方面的了解的基础上，针对不同的疾病（癌症，自身免疫病）设计相关药物，达到治愈的目的。（生物谷bioon.com）

谢谢分享，学习了。

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